Основна маса АТФ утворюється на мембранах мітохондрій в ході окисного фосфорилювання H-залежної АТФ-синтазою. Субстратне фосфорилювання АДФ не потребує участі мембранних ферментів, воно відбувається у цитоплазмі у процесі гліколізу або шляхом перенесення фосфатної групи з інших макроергічних сполук.
Гідроліз АТФ – Реакція, що протікає в м'язових волокнах, при якій АТФ, взаємодіючи з водою розпадається на АДФ та фосфорну кислоту (Н3РО4). У цьому виділяється енергія. Гідроліз АТФ прискорюється ферментом АТФ-Азою. Цей фермент знаходиться на кожній головці міозинової товстого філаменту.
Гідроліз (руйнування під дією води) АТФ призводить до відщеплення від його молекули фосфату з утворенням АДФ (аденозиндифосфату) та виділення енергії. Від молекули АДФ може відокремитись ще один фосфат, внаслідок чого утворюється АМФ (аденозинмонофосфат) і також виділяється енергія.